Outils moléculaires et génomique

Objectifs du chapitre

À la fin de ce chapitre, vous serez capable de:

• estimer la fréquence des sites d'une enzyme de restriction et construire une carte de restriction à partir de digestions lues sur un gel;
• calculer le nombre de copies produites par une PCR d'efficacité donnée, et relier le cycle seuil $C_t$ d'une PCR quantitative à la quantité de départ;
• convertir une masse d'ADN humain en nombre de copies du génome, et dire pourquoi quelques centaines de picogrammes suffisent à un profil d'ADN;
• expliquer le séquençage de Sanger et le séquençage à haut débit, et choisir une couverture avec le modèle de Lander et Waterman;
• décrire l'édition par CRISPR–Cas9 (ARN guide, PAM, cassure double brin, NHEJ ou recombinaison homologue) et distinguer thérapie génique ex vivo et in vivo;
• choisir la méthode adaptée à une question, et situer l'édition de la lignée germinale dans son débat éthique.

Couper l'ADN et le trier par taille

Les chapitres 7 à 10 ont décrit ce qu'est l'ADN, comment il se copie, code et se régule. Celui-ci décrit comment on le coupe, le multiplie, le lit et le modifie, avec les outils du diagnostic médical (chapitre 14) et du profil d'ADN forensique (chapitre 15).

Les enzymes de restriction

Les bactéries se défendent contre les bactériophages en coupant l'ADN étranger avec des enzymes de restriction, qui «restreignent» la croissance du phage. Une méthylase modifie les mêmes séquences dans l'ADN de la bactérie, que l'enzyme épargne: c'est le système de restriction-modification, un autre usage de la méthylation que celui du chapitre 10.

Les enzymes portent le nom de leur organisme d'origine: EcoRI vient d'Escherichia coli, BamHI de Bacillus amyloliquefaciens, HindIII d'Haemophilus influenzae. Le site d'EcoRI est 5′-GAATTC-3′, et le brin complémentaire, lu de 5′ vers 3′, porte la même séquence. L'enzyme coupe G^AATTC sur chaque brin et laisse un bout simple brin 5′-AATT qui dépasse: deux fragments coupés par EcoRI, d'où qu'ils viennent, peuvent s'apparier par ces quatre bases, ce qui a rendu le clonage possible. BamHI coupe G^GATCC et laisse un bout GATC; SmaI coupe CCC^GGG et laisse des extrémités franches.

Démonstration. Par indépendance, les $n$ bases sont toutes les bonnes avec la probabilité $p=(1/4{)}^n$. Chaque position est alors un essai de Bernoulli de paramètre $p$ (au chevauchement près, négligeable); le nombre de positions jusqu'au site suivant suit une loi géométrique d'espérance $1/p=4^n$ («Probabilités et statistique», chapitre 4). $\square$

Le modèle est grossier, et ses écarts instruisent. Avec environ 41 % de G + C dans le génome humain, soit $f(\mathrm{A})=f(\mathrm{T})=0,295$ et $f(\mathrm{G})=f(\mathrm{C})=0,205$, le site GAATTC revient tous les 3142 pb en moyenne plutôt que tous les 4096. Surtout, le dinucléotide CG est rare chez les mammifères, parce que la cytosine méthylée de CpG se désamine en thymine (chapitre 9): NotI (GC^GGCCGC) coupe bien plus rarement que $4^8$ ne le prévoit. Le modèle donne un ordre de grandeur, pas une carte.

L'électrophorèse sur gel

L'ADN porte une charge négative par phosphate: dans un champ électrique, il migre vers l'anode. Dans un gel d'agarose, réseau de polysaccharide aux mailles de la taille des molécules, les petits fragments se faufilent plus vite que les grands. On dépose les échantillons dans des puits, on applique une tension, puis on révèle l'ADN par un colorant fluorescent intercalant.

Sur une large plage de tailles, la distance parcourue décroît à peu près linéairement avec le logarithme de la taille. C'est une approximation, mais elle suffit: on fait migrer à côté des échantillons un marqueur de taille, mélange de fragments de longueurs connues, et l'on situe chaque bande entre deux bandes du marqueur. La précision est de quelques pour cent: un gel d'agarose distingue 1000 de 1100 pb, pas 1000 de 1003. Pour quelques bases, il faut un gel de polyacrylamide ou l'électrophorèse capillaire.

Pour retrouver un fragment dans la traînée d'un génome digéré, Edwin Southern a proposé en 1975 de transférer l'ADN du gel sur une membrane et de l'y détecter par une sonde marquée complémentaire: c'est le Southern blot (pour l'ARN, le Northern blot), dont le principe survit dans les puces à ADN et la capture des exons.

La logique de l'exemple 11.1 sert encore à vérifier un clonage, et elle a fourni l'un des premiers diagnostics moléculaires. La substitution c.20A>T de HBB, celle de la drépanocytose, change CCTGAGG en CCTGTGG et détruit un site de DdeI (CTNAG, N étant n'importe quelle base): l'allèle normal est coupé à cet endroit, l'allèle muté ne l'est pas. Un variant qui crée ou supprime un site donne un polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP), le premier marqueur moléculaire de la cartographie (le marqueur de Gusella, 1983, chapitre 5) et, appliqué aux minisatellites, de la génétique forensique avant les microsatellites (chapitre 15).

Cloner un fragment

Cloner un fragment d'ADN, c'est en obtenir de nombreuses copies identiques en le faisant répliquer par une cellule hôte, le plus souvent E. coli, après l'avoir inséré dans une molécule capable de se répliquer seule.

Le clonage classique enchaîne quatre étapes.

1. Couper le vecteur et l'insert par la même enzyme, ou par des enzymes aux extrémités compatibles.
2. Lier: l'ADN ligase referme les liaisons phosphodiester, comme pour les fragments d'Okazaki (chapitre 7); on obtient un plasmide recombinant.
3. Transformer: faire entrer les plasmides dans des bactéries rendues perméables par un choc thermique ou électrique; seule une petite fraction en reçoit un.
4. Sélectionner sur un milieu avec l'antibiotique: seules les bactéries qui ont reçu un plasmide forment des colonies. Chaque colonie descend d'une cellule et porte une seule molécule recombinante, multipliée: c'est un clone.

Reste à écarter les vecteurs refermés sans insert. Beaucoup de vecteurs placent le site de clonage dans un fragment de lacZ, le gène de la β-galactosidase de l'opéron lactose (chapitre 10). Sans insert, l'enzyme active clive un substrat incolore ajouté au milieu en un produit bleu; un insert interrompt lacZ et la colonie reste blanche. On vérifie ensuite l'insert des colonies blanches par une digestion (exercice 11.5) ou par séquençage.

Un vecteur d'expression place l'insert derrière un promoteur fort: l'insuline humaine produite par des bactéries a été, au début des années 1980, le premier médicament du génie génétique. Les chromosomes artificiels de bactérie ou de levure (BAC, YAC) acceptent des centaines de kilobases et ont servi au premier séquençage du génome humain. Pour cloner la partie codante d'un gène eucaryote sans ses introns (chapitre 8), on recopie l'ARNm en ADN complémentaire (ADNc) par la transcriptase inverse des rétrovirus.

La PCR: amplifier sans cloner

Le cycle

Le clonage multiplie un fragment déjà isolé, en quelques jours. La réaction de polymérisation en chaîne, conçue au milieu des années 1980, le multiplie en quelques heures dans un tube, au sein d'un génome entier et à partir de quelques copies.

À environ 95 °C, les deux brins se séparent (figure 11.2). Vers 50 à 65 °C, selon leur séquence, les amorces, en grand excès, s'hybrident à leurs sites avant que les brins matrices ne se réapparient. À environ 72 °C, la polymérase allonge chaque amorce de 5′ vers 3′. Le pas décisif a été l'ADN polymérase de Thermus aquaticus, bactérie des sources chaudes: la «Taq» supporte les passages à 95 °C, et un thermocycleur enchaîne les cycles sans rajout d'enzyme.

La méthode doit sa puissance à deux propriétés. La spécificité: dans une séquence aléatoire (théorème 11.1), une séquence de 20 nt apparaît à une position donnée avec la probabilité $(1/4{)}^{20}$, et $4^{20}\approx 1,10\times 10^{12}$ dépasse de loin les $2\times 3,1\times 10^9$ positions des deux brins du génome haploïde: on attend environ occurrence fortuite. Une amorce bien choisie n'a qu'un site, et il en faut deux, bien placées, pour obtenir un produit. La du produit: les premiers brins neufs dépassent la cible, et les doubles brins bornés exactement par les amorces n'apparaissent qu'au troisième cycle; après cycles, ils sont sur molécules, la quasi-totalité dès le dixième cycle.

Croissance exponentielle, efficacité et plateau

Démonstration. À chaque cycle, chacune des $N_k$ copies présentes est recopiée avec la probabilité $E$; en moyenne $N_{k+1}=N_k+E{N}_k=(1+E)N_k$, et la récurrence donne (11.2). On résout en prenant le logarithme: , d'où (11.3). Remplacer par diminue de , donc de , qui vaut 1 si .

La formule (11.2) ne vaut qu'en phase exponentielle. Ensuite, amorces et nucléotides s'épuisent, la polymérase s'use, et les produits se réapparient entre eux plutôt qu'avec les amorces: l'efficacité chute et la courbe atteint un plateau, dont la hauteur dépend des réactifs plus que de $N_0$. Deux échantillons qui différaient d'un facteur 10 peuvent finir au même plateau: l'information quantitative est dans la phase exponentielle, celle qu'exploite la PCR quantitative.

La PCR quantitative et le cycle seuil

Par (11.3), $C_t$ est une fonction affine de ${\log }_{10}{N}_0$. Une courbe étalon, série de dilutions d'une quantité connue, le vérifie et mesure l'efficacité: la pente vaut $-1/{\log }_{10}(1+E)$, soit à (une dilution par 10 retarde le seuil de 3,32 cycles), d'où (exercice 11.2).

Pour mesurer l'expression d'un gène, on recopie d'abord son ARNm en ADNc par la transcriptase inverse, puis on l'amplifie: c'est la RT-PCR, quantitative si on la suit en temps réel (RT-qPCR). On rapporte le gène étudié à un gène de référence exprimé de façon stable: l'écart des écarts, $\Delta \Delta C_t$, corrige des quantités d'ARN différentes (exercice 11.3). On élimine l'ADN génomique contaminant et l'on place les amorces de part et d'autre d'un intron. La RT-qPCR détecte aussi les virus à ARN et estime leur charge: ce fut l'un des tests les plus pratiqués pendant la pandémie de COVID-19.

Dans l'explorateur 11.1, le plateau vient d'un frein logistique choisi pour l'illustration, $N_{k+1}=N_k+E{N}_k(1-N_k/K)$, où est la capacité du tube: ce n'est pas la cinétique réelle d'une PCR. Avec les valeurs de l'exemple 11.3, le lu sur la courbe et celui de (11.3) coïncident à un dixième de cycle près, car le seuil est atteint bien avant le plateau. Doublez la matrice: le diminue d'un cycle à , d'un peu plus à .

Combien de copies dans un nanogramme?

Une PCR compte des molécules; un laboratoire pèse. Avec la taille du génome (chapitre 7) et une masse moyenne d'environ 650 g·mol⁻¹ par paire de bases (valeur approchée), un génome humain haploïde de $3,1\times 10^9$ pb pèse

et une cellule diploïde environ 6,69 pg. Un nanogramme d'ADN humain contient donc environ 300 copies du génome haploïde, l'ADN d'environ 150 cellules: 300 matrices par locus autosomique.

Les kits forensiques qui amplifient ensemble une vingtaine de microsatellites (chapitre 15) sont conçus pour une matrice de l'ordre du nanogramme ou moins, quelques centaines de picogrammes: l'ADN de quelques dizaines à une centaine de cellules. Une trace de contact en contient parfois bien moins. Le laboratoire quantifie donc chaque extrait par qPCR, souvent avec une cible humaine et une cible du chromosome Y, pour savoir combien en engager. Avec quelques copies par locus, le hasard peut écarter un allèle d'un hétérozygote (cours «ADN forensique»).

Lire l'ADN

L'électrophorèse capillaire et la fluorescence

Lire une séquence, ou distinguer deux allèles de microsatellite qui diffèrent d'une base, exige une résolution d'une paire de bases sur quelques centaines. L'électrophorèse capillaire l'atteint: les fragments simple brin migrent dans un tube de verre très fin rempli d'un polymère et passent devant un laser qui excite leurs marqueurs fluorescents. La fluorescence enregistrée en fonction du temps forme un électrophérogramme, dont chaque pic donne une taille par sa position et un marqueur par sa couleur.

Deux idées la rendent sûre. Le marquage par plusieurs fluorochromes, quatre à six selon les appareils, permet d'analyser ensemble des produits de tailles qui se chevauchent. L'étalon de taille interne, des fragments de tailles connues d'une couleur à part ajoutés à chaque échantillon, sert de règle dans le même capillaire. On désigne ainsi sans ambiguïté l'allèle 9.3 de TH01, plus long de trois bases que l'allèle 9 et plus court d'une base que l'allèle 10 (chapitre 15). En diagnostic, la délétion c.1521_1523del de CFTR, la plus fréquente de la mucoviscidose, raccourcit de 3 pb le produit de PCR qui la contient: l'électrophorèse capillaire la voit.

La chaîne d'un profil d'ADN forensique en découle: extraire, quantifier par qPCR, amplifier les microsatellites par une PCR multiplexe aux amorces fluorescentes, séparer par électrophorèse capillaire, interpréter l'électrophérogramme.

Le séquençage de Sanger

Frederick Sanger et ses collègues ont publié en 1977 la méthode qui a lu les séquences pendant trente ans, premier génome humain compris.

On trie ensuite ces fragments par longueur, à une base près, par électrophorèse capillaire. Le plus court passe en premier, et sa couleur donne la première base synthétisée après l'amorce; le suivant, la deuxième, et ainsi de suite. La suite des couleurs est la séquence du brin synthétisé, de 5′ vers 3′: le complément du brin matrice. La proportion de ddNTP est réglée pour que chaque position soit représentée.

Le résultat est un chromatogramme, une suite de pics colorés avec, pour chacun, une base et une qualité. Une lecture fiable couvre quelques centaines de bases, de l'ordre de 800 au mieux: au-delà, des fragments qui diffèrent d'une base sur mille ne se séparent plus. Chez un hétérozygote, le variant montre deux pics superposés de couleurs différentes, chacun d'environ la moitié de la hauteur des voisins. Une délétion hétérozygote comme c.1521_1523del donne une trace propre jusqu'au variant, puis des pics doubles partout au-delà, les deux allèles étant décalés.

Sanger reste la méthode de choix pour une région courte: vérifier un clone, chercher une mutation dans un exon, confirmer un variant trouvé autrement.

Le séquençage à haut débit

Depuis le milieu des années 2000, on lit des centaines de millions de fragments en parallèle. On fragmente l'ADN en morceaux de quelques centaines de paires de bases, on fixe à leurs extrémités des adaptateurs de séquence connue (la banque), et chaque fragment est amplifié sur une lame de verre en un petit amas de copies identiques.

La méthode la plus répandue est le séquençage par synthèse à terminateurs réversibles: à chaque cycle, la polymérase ajoute à chaque amas un seul nucléotide, fluorescent et bloqué en 3′; une caméra lit la couleur de chaque amas, puis on retire fluorochrome et blocage. Chaque amas livre ainsi une lecture courte de 100 à 300 bases environ; on lit souvent les deux extrémités de chaque fragment (paired-end).

Les lectures longues suivent en temps réel une polymérase sur une seule molécule, ou mesurent le courant à travers un nanopore que traverse le brin. Elles atteignent des dizaines de milliers de bases et franchissent les longues répétitions que les lectures courtes ne savent pas situer; leur taux d'erreur, longtemps plus élevé, a beaucoup baissé.

Chaque base lue porte une qualité de Phred, $Q=-10{\log }_{10}\epsilon$, où $\epsilon$ est la probabilité d'erreur: $Q=30$ correspond à $10^{-3}$, $Q=20$ à . Une seule lecture ne suffit donc pas à affirmer un variant: on lit chaque position plusieurs fois.

La couverture et le modèle de Lander et Waterman

La couverture s'écrit $C$ majuscule, pour la distinguer du coefficient de coïncidence $c$ du chapitre 5. Une couverture de 30× ne dit pas que chaque base est lue 30 fois: les lectures tombent au hasard, et certaines bases ne sont lues par aucune. Combien?

Démonstration. Une lecture recouvre une base donnée si elle commence dans les $L$ positions qui la précèdent, ce qui arrive avec la probabilité $L/G$. Les $N$ lectures étant indépendantes, la profondeur suit une loi binomiale de paramètres $N$ et $L/G$, d'espérance $NL/G=C$. Pour $N$ grand et $L/G$ petit, cette binomiale est approchée par une loi de Poisson de même espérance («Probabilités et statistique», chapitre 4), et .

La fraction non couverte vaut $e^{-1}\approx 0,368$ à 1×, $e^{-5}\approx 0,0067$ à 5×, $e^{-10}\approx 4,5\times 10^{-5}$ à 10×, à 30×. Le modèle est : les régions extrêmes en GC sont moins bien lues, et une lecture courte tombée dans un élément Alu, qui occupe environ 10 % du génome (chapitre 7), ne peut pas être située. Les vraies lacunes sont plus nombreuses que ne le prédit (11.4).

Aligner et appeler les variants

Pour un organisme déjà séquencé, on aligne chaque lecture sur un génome de référence, à la position où elle correspond le mieux en tolérant quelques différences. Chaque alignement reçoit une qualité; une lecture tombée dans une répétition parfaite reçoit une qualité nulle, puisqu'elle pourrait venir de n'importe quelle copie.

Vient l'appel des variants: en chaque position, la pile des lectures alignées, leur profondeur et leurs qualités décident si l'individu est homozygote pour la base de référence, hétérozygote, ou homozygote pour une autre base. On repère aussi les petites insertions et délétions et, plus difficilement, les variants de structure et de nombre de copies (chapitre 6). Le résultat est une liste de différences avec la référence, en nomenclature HGVS (chapitre 9): plusieurs millions par génome humain, presque toutes sans conséquence.

Sans référence, on assemble les lectures en raboutant celles qui se chevauchent, comme un puzzle sans modèle; les répétitions plus longues que les lectures y sont des pièces identiques qu'on ne sait où placer, et les lectures longues y sont décisives.

En diagnostic, un panel cible les gènes connus d'une famille de maladies; l'exome capture par des sondes les exons codants de tous les gènes, de l'ordre de 1 à 2 % du génome, où se trouvent la plupart des variants pathogènes connus; le génome entier voit aussi le non-codant et les variants de structure. Le choix et la classification des variants relèvent du chapitre 14.

Génomes de référence et puces à SNP

Un génome de référence est une séquence assemblée, publiée et versionnée, qui sert de système de coordonnées à une espèce: on y aligne les lectures et l'on y décrit les variants d'un individu. Ce n'est pas le génome d'un individu «normal», mais une mosaïque de quelques donneurs ou un individu choisi pour des raisons techniques.

Le projet public de séquençage du génome humain, lancé en 1990, a publié une ébauche en 2001, en même temps qu'une entreprise privée, puis une version dite achevée en 2004, limitée à l'euchromatine. Même la référence de la plupart des laboratoires, GRCh38 (2013), laisse de côté environ 8 % du génome: centromères, bras courts des acrocentriques, grandes répétitions en tandem (Nurk et al., Science 2022). En 2022, le consortium Telomere-to-Telomere a publié la première séquence complète d'un génome humain, T2T-CHM13: environ 3,055 Gb pour les 22 autosomes et le X, d'un télomère à l'autre, grâce aux lectures longues (même article). Les chromosomes de cette lignée cellulaire viennent tous d'un même spermatozoïde, ce qui évite de séparer deux haplotypes.

Une référence unique ne représente pas la diversité humaine: un segment qui lui manque ne reçoit aucune lecture. On construit donc aussi des références qui rassemblent, sous forme de graphe, les génomes de personnes d'origines variées.

Pour génotyper beaucoup de personnes en des positions déjà connues pour varier, une puce à SNP suffit: des centaines de milliers à quelques millions de sondes, chacune pour un polymorphisme d'un nucléotide (SNP), auxquelles l'ADN s'hybride; un signal fluorescent donne les allèles. Les puces sont l'outil des études d'association (chapitre 13) et des tests vendus directement aux consommateurs, que la loi fédérale sur l'analyse génétique humaine (LAGH, RS 810.12) encadre (chapitre 14). Elles ne lisent que ce qu'on leur demande: un variant rare absent de la puce reste invisible.

Modifier le génome

CRISPR–Cas9

Les bactéries ont une seconde défense contre les phages. Elles conservent, entre de courtes répétitions (clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR), des fragments de l'ADN des phages qui les ont attaquées; transcrits, ces fragments guident une nucléase vers l'ADN du phage s'il revient. En 2012, l'équipe d'Emmanuelle Charpentier et de Jennifer Doudna a montré que la nucléase Cas9 de Streptococcus pyogenes, guidée par un ARN programmable, coupe in vitro l'ADN double brin à l'endroit voulu (prix Nobel de chimie 2020).

Changer de cible ne demande que de changer les 20 nt de l'espaceur (figure 11.3), là où les méthodes précédentes demandaient une protéine nouvelle pour chaque cible: c'est ce qui a rendu l'outil universel. La contrainte du PAM est légère: dans une séquence aléatoire, un GG se trouve en moyenne toutes les 16 positions sur chaque brin. La spécificité vient de la longueur de l'espaceur, comme pour une amorce; elle n'est pas absolue, car Cas9 tolère quelques mésappariements et peut couper des sites hors cible de séquence voisine, qu'il faut rechercher avant tout usage thérapeutique.

Une cassure double brin est une lésion grave, que la cellule répare par les deux voies du chapitre 9.

• La jonction d'extrémités non homologues (NHEJ) recolle directement les deux bouts, à toutes les phases du cycle, mais en ajoutant ou retirant souvent quelques nucléotides; une réparation exacte est recoupée par Cas9 jusqu'à ce qu'une erreur détruise la cible. Dans un exon, une insertion ou délétion non multiple de 3 décale le cadre de lecture (chapitre 8) et produit en général un stop prématuré: le gène est inactivé (knock-out).
• La réparation dirigée par homologie (HDR), une forme de recombinaison homologue, recopie une séquence homologue. Si l'on fournit une matrice donneuse, identique à la région autour de la coupure mais portant la modification voulue, la cellule peut la recopier: on introduit une mutation précise ou un gène entier (knock-in). Cette voie, qui utilise normalement la chromatide sœur en phase S ou G2, n'opère que dans les cellules qui se divisent et reste minoritaire.

Les éditeurs de bases changent une seule base sans cassure double brin: une Cas9 qui ne coupe plus les deux brins, fusionnée à une désaminase, convertit par exemple C en T ou A en G dans la cible. L'édition prime recopie une courte séquence portée par l'ARN guide. Tous deux évitent les insertions et délétions aléatoires de la NHEJ.

Organismes transgéniques et organismes modèles

Un organisme transgénique porte un ADN qu'on a introduit dans son génome. Ces outils ont rendu la modification routinière chez les organismes modèles: E. coli, la levure Saccharomyces cerevisiae, la drosophile, le nématode Caenorhabditis elegans, l'arabette Arabidopsis thaliana, le poisson-zèbre et la souris. Leurs gènes ont souvent des homologues humains: inactiver un gène chez la souris éclaire la fonction de l'homologue humain et peut reproduire une maladie. Il suffit aujourd'hui d'injecter Cas9 et l'ARN guide dans un œuf fécondé, là où il fallait une recombinaison homologue dans des cellules souches embryonnaires et des générations de croisements.

Des plantes transgéniques résistantes à des insectes ou tolérantes à un herbicide sont cultivées sur de grandes surfaces dans plusieurs pays. La Suisse applique depuis une votation populaire de 2005 un moratoire sur leur culture commerciale, prolongé depuis par le Parlement; le régime des plantes éditées sans ADN étranger est débattu.

La thérapie génique

Les vecteurs sont le plus souvent des virus rendus incapables de se multiplier. Les rétrovirus et lentivirus intègrent leur génome dans celui de la cellule: l'effet est durable et passe aux cellules filles, ce qui convient aux cellules souches, mais une insertion en partie aléatoire peut activer un oncogène. Les virus adéno-associés (AAV) restent pour l'essentiel hors des chromosomes: ils conviennent aux cellules qui ne se divisent plus, neurones ou rétine, mais se diluent dans un tissu qui prolifère et n'emportent que quelques kilobases.

Entre 1999 et 2003, un patient est mort d'une réaction inflammatoire au vecteur lors d'un essai, et plusieurs enfants traités pour un déficit immunitaire héréditaire ont développé une leucémie, le vecteur rétroviral s'étant inséré près d'un oncogène. Les vecteurs ont été redessinés, et plusieurs thérapies géniques sont aujourd'hui autorisées.

L'édition du génome s'y est ajoutée. Dans la drépanocytose et la β-thalassémie, l'hémoglobine adulte est défaillante; l'hémoglobine fœtale, elle, s'éteint après la naissance sous l'action d'un répresseur, BCL11A. Une thérapie autorisée en 2023 au Royaume-Uni et aux États-Unis prélève les cellules souches hématopoïétiques du patient, inactive par CRISPR–Cas9 un amplificateur (chapitre 10) qui commande BCL11A dans la lignée des globules rouges, puis réinjecte les cellules: l'hémoglobine fœtale revient et compense. Thérapie ex vivo et somatique, elle ne corrige pas la mutation de HBB: elle en contourne l'effet par la régulation.

L'édition de la lignée germinale

Modifier un embryon ou un gamète modifierait toutes les cellules de l'enfant, cellules germinales comprises: la modification passerait aux générations suivantes. En novembre 2018, un chercheur chinois a annoncé la naissance de jumelles dont les embryons avaient été modifiés par CRISPR–Cas9 au gène CCR5, qui code un corécepteur du VIH, pour les rendre résistantes à l'infection. La communauté scientifique l'a condamné: les enfants n'étaient pas malades, d'autres moyens évitaient la transmission du virus, l'édition était en partie en mosaïque, ses effets hors cible inconnus, et le consentement des parents contesté. Un tribunal chinois l'a condamné à une peine de prison en 2019.

L'affaire a rendu concrètes trois questions. Le risque: une erreur hors cible ou une mosaïque chez un embryon ne se corrige pas et se transmet. La frontière: corriger une mutation grave n'est pas améliorer un trait, mais la distinction est-elle stable? La nécessité: le diagnostic préimplantatoire (chapitre 14) permet déjà, le plus souvent, de choisir un embryon non atteint. En Suisse, la Constitution fédérale interdit les interventions dans le patrimoine génétique des gamètes et des embryons humains; la thérapie génique somatique relève du droit des médicaments et des essais cliniques.

Synthèse

• Une enzyme de restriction coupe à un site court et palindromique, en laissant des extrémités cohésives ou franches; dans une séquence aléatoire, un site de $n$ pb revient tous les $4^n$ pb en moyenne. L'électrophorèse sépare les fragments à peu près linéairement en $\log$(taille), et des digestions simples et doubles donnent une carte de restriction. Le clonage insère un fragment dans un vecteur que la bactérie réplique; antibiotique et crible bleu-blanc trient les recombinants.
• La PCR amplifie une région bornée par deux amorces: $N_n=N_0(1+E{)}^n$ en phase exponentielle, copies après 30 cycles à 100 %, 21,5 % de cela à 90 %. Le mesure la quantité de départ; doubler la matrice l'avance d'un cycle à . La mesure un ARN.

Exercices

Vous pouvez afficher le corrigé directement sous chaque énoncé après avoir cherché la solution.

Références

• Strachan, T. & Read, A., Human Molecular Genetics, CRC Press.
• Klug, W. S., Cummings, M. R., Spencer, C. A. & Palladino, M. A., Concepts of Genetics, Pearson (en français: Génétique, Pearson).
• Griffiths, A. J. F., Doebley, J., Peichel, C. & Wassarman, D. A., Introduction to Genetic Analysis, Macmillan (en français: Introduction à l'analyse génétique, De Boeck).
• Lander, E. S. & Waterman, M. S. (1988), «Genomic mapping by fingerprinting random clones: a mathematical analysis», Genomics 2, 231–239.
• Nurk, S. et al. (2022), «The complete sequence of a human genome», Science 376, 44–53.
• Butler, J. M., Advanced Topics in Forensic DNA Typing: Interpretation, Academic Press, 2015.