Objectifs du chapitre
À la fin de ce chapitre, vous serez capable de:
- retracer le passage de «un gène, une enzyme» à «un gène, plusieurs produits», et situer le dogme central et ses exceptions;
- décrire la transcription chez les bactéries et chez les eucaryotes, et passer sans erreur du brin matrice au brin codant et à l'ARN messager;
- expliquer la maturation d'un pré-ARNm eucaryote (coiffe, queue poly(A), épissage des introns) et dénombrer les produits d'un épissage alternatif;
- lire le code génétique, justifier ses propriétés (triplets, dégénérescence, vacillement, quasi-universalité) à partir des expériences qui les ont établies;
- traduire une séquence dans ses six cadres de lecture, y repérer les cadres de lecture ouverts et prévoir l'effet d'une substitution, d'une insertion ou d'une délétion;
- décrire la traduction au ribosome (charge des ARNt, sites A, P et E, initiation, élongation, terminaison) et la colinéarité du gène et de la protéine, avec ses limites chez les eucaryotes.
Du «un gène, une enzyme» au dogme central
Ce que fait un gène: Garrod, Beadle et Tatum
Mendel avait montré comment se transmettent les gènes (chapitre 2), la théorie chromosomique les avait logés sur les chromosomes (chapitres 1 et 3); restait à savoir ce qu'un gène fait. La première réponse est médicale. En 1902, Archibald Garrod remarque que l'alcaptonurie, où l'urine noircit à l'air, se transmet comme un caractère récessif et s'accompagne de l'accumulation d'un intermédiaire, l'acide homogentisique. Il parle d'«erreur innée du métabolisme»: un gène défectueux, une étape bloquée.
L'idée devient un programme expérimental avec George Beadle et Edward Tatum, en 1941. La moisissure Neurospora crassa pousse sur un milieu minimal parce qu'elle synthétise elle-même ses acides aminés. Beadle et Tatum irradient des spores et recherchent les mutants auxotrophes, qui ne poussent plus que si l'on ajoute un nutriment précis. Chaque mutation se transmet comme un seul gène mendélien (Neurospora est haploïde: un croisement avec la souche sauvage donne des spores mutantes et sauvages à 1:1), et chacune supprime une seule étape d'une voie de biosynthèse.
L'analyse la plus citée porte sur la voie de l'arginine (Srb et Horowitz, 1944). Les mutants qui exigent l'arginine se répartissent en trois classes selon ce qui les sauve: la première pousse avec l'ornithine, la citrulline ou l'arginine; la deuxième avec la citrulline ou l'arginine, mais pas l'ornithine; la troisième avec l'arginine seulement. La seule voie compatible avec ces trois profils est
un mutant étant sauvé par tout composé situé après son blocage, et par aucun composé situé avant. Le raisonnement ordonne les intermédiaires sans les doser: c'est de la génétique pure, et il conduit à l'hypothèse un gène, une enzyme.
La phénylcétonurie, que le chapitre 14 traite sous l'angle du dépistage, en est la version humaine: les deux allèles de PAH sont défectueux, la phénylalanine hydroxylase manque, et la phénylalanine s'accumule.
Dans la voie précurseur → ornithine → citrulline → arginine, un mutant de Neurospora pousse sur milieu minimal additionné de citrulline ou d'arginine, mais pas d'ornithine. Quelle étape est bloquée?
Un gène, un polypeptide
La formule a dû être élargie dès que l'on a connu la structure des protéines. L'hémoglobine adulte, l'hémoglobine A, est un tétramère de deux chaînes α et de deux chaînes β, codées par des gènes différents: HBA1 et HBA2 (deux copies presque identiques, chromosome 16) pour l'α, HBB (chromosome 11) pour la β. Une protéine dépend donc de plusieurs gènes, et un défaut de HBB n'atteint que la chaîne β. Beaucoup de protéines ne sont d'ailleurs pas des enzymes. D'où la formulation un gène, un polypeptide.
Le gène de la β-globine, HBB, sert de fil conducteur à ce chapitre: il est court, connu dans ses moindres détails, et siège de la drépanocytose (chapitres 9 et 14) et des β-thalassémies (chapitre 9, exemples 9.1 et 9.4). Sa chaîne mature compte 146 acides aminés.
Le dogme central et ses exceptions
Francis Crick a résumé en 1958, puis reformulé en 1970, le flux de l'information: de l'ADN à l'ADN (réplication, chapitre 7), de l'ADN à l'ARN (transcription), de l'ARN à la protéine (traduction), jamais de la protéine vers les acides nucléiques. C'est cette interdiction que Crick appelait le dogme central: une affirmation sur ce qui ne se produit pas, plus qu'un schéma ADN → ARN → protéine.
Deux familles de faits ont élargi le schéma sans contredire l'interdiction.
- La transcription inverse. En 1970, Howard Temin et David Baltimore découvrent indépendamment, chez des rétrovirus, une ADN polymérase qui copie l'ARN en ADN, la transcriptase inverse. Le VIH l'utilise pour intégrer son génome dans celui de la cellule, ce qui en fait une cible thérapeutique («Pharmacologie»). Les éléments LINE et Alu du chapitre 7 se multiplient eux aussi par un intermédiaire ARN recopié en ADN, et le laboratoire s'en sert pour obtenir un ADN complémentaire (ADNc), base de la RT-PCR (chapitre 11).
- Les gènes à ARN. Beaucoup de gènes ne codent aucune protéine: leur produit final est un ARN. ARN ribosomiques et ARN de transfert, petits ARN nucléaires de l'épissage, micro-ARN qui règlent d'autres gènes (chapitre 10), longs ARN non codants comme celui de XIST (chapitre 3). Certains ARN catalysent même des réactions, les ribozymes: Thomas Cech a montré en 1982 qu'un intron du cilié Tetrahymena s'excise seul.
Le flux d'information reste donc orienté, mais «gène» ne veut plus dire «protéine».
La transcription
Brin matrice et brin codant
Une ARN polymérase synthétise un ARN complémentaire de l'un des deux brins de l'ADN. Comme toutes les polymérases d'acides nucléiques, elle allonge la chaîne dans le sens 5′→3′, en lisant le brin copié dans le sens 3′→5′: les deux brins de la double hélice sont antiparallèles (chapitre 7), et l'ARN est antiparallèle au brin qu'il copie. Contrairement à l'ADN polymérase, elle n'a pas besoin d'amorce.
Le choix du brin se fait gène par gène: le long d'un chromosome, chaque brin sert de matrice aux uns et de brin codant aux autres.
Le brin matrice d'un petit gène s'écrit 5′-TTACCCAGCGGTCAT-3′. Quel est l'ARNm transcrit, écrit de 5′ à 3′?
Chez les bactéries
Chez Escherichia coli, une seule ARN polymérase transcrit tous les gènes. Son cœur (sous-unités ) sait allonger un ARN mais ne sait pas où commencer; il s'associe à un facteur σ pour former l'holoenzyme, et c'est σ qui reconnaît le promoteur.
Chez E. coli, les promoteurs reconnus par le facteur σ principal partagent deux courts motifs, vers les positions et , de séquences consensus TATAAT et TTGACA sur le brin codant. «Consensus» désigne la base la plus fréquente à chaque position: aucun promoteur réel ne l'a forcément, et plus il s'en écarte, moins il est en général efficace.
La transcription se déroule en trois temps.
- Initiation. L'holoenzyme se fixe au promoteur, ouvre localement la double hélice et place le premier ribonucléotide en face de la position ; elle quitte ensuite le promoteur et σ se détache.
- Élongation. Le cœur progresse en déroulant l'ADN devant lui et en le refermant derrière; l'ARN naissant ne reste apparié à la matrice que sur quelques nucléotides.
- Terminaison. Dans la terminaison intrinsèque, l'ARN forme une épingle à cheveux riche en GC suivie d'une série de U: l'épingle bloque la polymérase et les appariements A–U, faibles, lâchent. Dans la terminaison dépendante de Rho, une hélicase rattrape la polymérase et décroche l'ARN.
Une bactérie n'a pas de noyau: les ribosomes s'attachent à l'ARNm pendant sa transcription. Transcription et traduction sont couplées, et un ARNm bactérien est souvent polycistronique: il porte à la suite les régions codantes des gènes d'un opéron (chapitre 10).
Chez les eucaryotes
Le noyau eucaryote utilise trois ARN polymérases: l'ARN polymérase I pour les grands ARN ribosomiques, l'ARN polymérase II pour tous les ARN messagers (et la plupart des micro-ARN et des petits ARN nucléaires), l'ARN polymérase III pour les ARN de transfert, l'ARN ribosomique 5S et d'autres petits ARN.
Aucune de ces polymérases ne reconnaît seule un promoteur. Pour l'ARN polymérase II, des facteurs généraux de transcription s'assemblent d'abord sur le promoteur; dans beaucoup de promoteurs, une boîte TATA, une trentaine de paires de bases en amont du site d'initiation, est reconnue par la protéine TBP du facteur TFIID, puis la polymérase est recrutée. L'efficacité de ce démarrage dépend de séquences parfois éloignées et de la chromatine (chapitre 10). La queue de la grande sous-unité de l'ARN polymérase II sert de plate-forme aux enzymes de maturation: l'ARN est coiffé, épissé et coupé pendant sa synthèse, et la terminaison suit la coupure de l'extrémité 3′.
La maturation des ARN messagers eucaryotes
Le produit direct de l'ARN polymérase II est un transcrit primaire, ou pré-ARNm. Il n'est exporté vers le cytoplasme qu'après trois modifications: une coiffe à son extrémité 5′, une queue poly(A) à son extrémité 3′ et l'excision de ses introns.
La coiffe et la queue poly(A)
Dès que l'ARN naissant compte quelques dizaines de nucléotides, son extrémité 5′ reçoit une coiffe: une guanosine méthylée en position 7 (m⁷G), liée au premier nucléotide par une liaison 5′–5′ triphosphate. La coiffe protège l'ARNm des exonucléases, sert à son export, et c'est par elle que le ribosome eucaryote reconnaît l'ARNm.
À l'autre extrémité, un complexe reconnaît le signal AAUAAA et coupe l'ARN une vingtaine de nucléotides plus loin; une poly(A) polymérase ajoute alors, sans matrice, une queue poly(A) de l'ordre de 200 adénines chez les mammifères, qui participe à la stabilité de l'ARNm (chapitre 10).
Exons, introns et épissage
En 1977, les équipes de Phillip Sharp et de Richard Roberts constatent, chez un adénovirus, qu'un ARNm hybridé à son ADN laisse des boucles d'ADN non appariées: le gène contient des segments absents de l'ARN mature. Les gènes eucaryotes sont morcelés.
Chez l'humain, la plupart des gènes codant une protéine ont plusieurs introns, souvent plus longs que les exons. Le gène HBB en est un exemple modeste: trois exons et deux introns, d'environ 130 et 850 pb. La figure 8.1 suit ce gène de l'ADN à la protéine.
L'épissage doit être exact au nucléotide près: un décalage d'une base aux jonctions changerait toute la protéine en aval (section «Cadres de lecture et ORF» ci-dessous). Trois signaux du pré-ARNm le guident. Presque tous les introns commencent par GU à leur extrémité 5′ (site donneur) et finissent par AG à leur extrémité 3′ (site accepteur): c'est la règle GU–AG (GT–AG sur l'ADN). Un peu en amont du site accepteur se trouve un point de branchement, une adénine, suivi d'une région riche en pyrimidines.
La machine qui opère est le spliceosome (ou épissosome), un grand complexe de cinq petits ARN nucléaires (U1, U2, U4, U5, U6) et de nombreuses protéines; U1 reconnaît le site donneur par appariement de bases, U2 le point de branchement. La chimie tient en deux transestérifications. Le 2′-OH de l'adénine du point de branchement attaque le site donneur: l'exon amont est libéré et l'extrémité 5′ de l'intron se lie à l'adénine, formant une boucle à queue, le lasso. Puis le 3′-OH de l'exon amont attaque le site accepteur: les exons sont joints et le lasso est relâché, puis dégradé. Une petite famille d'introns suit la règle AU–AC et passe par un spliceosome mineur.
L'épissage a une conséquence médicale directe. Une mutation qui détruit un site donneur ou accepteur fait sauter un exon ou retenir un intron; une mutation qui crée un site supplémentaire fait épisser au mauvais endroit. Une part importante des allèles de β-thalassémie agit ainsi: la séquence codante est intacte, mais l'ARNm qui en sort ne l'est pas (chapitre 9, exemple 9.4; le problème guidé 8.1 suit un cas de site donneur muté).
Les introns intéressent aussi la science forensique. Les marqueurs STR des profils d'ADN (chapitre 15) ont été choisis dans des régions non codantes, pour que leur variabilité ne dise rien de la santé de la personne: le marqueur TH01 est une répétition située dans le premier intron du gène de la tyrosine hydroxylase, d'où son nom.
La chaîne β mature compte 146 acides aminés; elle est traduite avec une méthionine initiatrice, retirée ensuite, et le dernier codon de la région codante est un stop. Combien de nucléotides compte la région codante de l'ARNm de HBB, du A de l'AUG au dernier nucléotide du codon stop inclus?
Le code génétique
Un code de triplets
Quatre bases doivent spécifier vingt acides aminés: un code à deux bases n'offre que mots, un code à trois bases . Ce calcul fixe une longueur minimale; c'est l'expérience qui a montré que le code est fait de triplets (section «Comment le code a été déchiffré»). Voici d'abord le résultat.
Justification. Ces propriétés sont empiriques. Les points 1 et 3 viennent des mutants de décalage de Crick et collègues (1961); les points 4 et 5 du déchiffrement des 64 codons (1961–1966); le point 2 de ce qu'une substitution d'une base change au plus un acide aminé, alors qu'un code chevauchant en changerait jusqu'à trois; le point 6 de la comparaison des gènes et des protéines de nombreux organismes.
La figure 8.2 donne la table: première base en bloc de lignes, deuxième en colonne, troisième en ligne à l'intérieur du bloc.
Deux régularités se lisent sur la table. La troisième position compte le moins: dans huit blocs sur seize elle est indifférente, et dans presque tous les autres seule compte la distinction purine (A, G) – pyrimidine (U, C). Un U en deuxième position donne toujours un acide aminé hydrophobe (Phe, Leu, Ile, Met, Val). Une substitution d'une base tend donc à conserver l'acide aminé ou à le remplacer par un voisin: le code est en partie tolérant aux erreurs.
Cadres de lecture et ORF
Rien dans une séquence n'indique où commencent les codons. Une suite de bases se découpe en triplets de trois façons, selon la base de départ: ce sont ses trois cadres de lecture. Chaque brin pouvant servir de matrice, un segment d'ADN double brin a six cadres de lecture, trois par brin, lus de 5′ à 3′.
Pourquoi un ORF long signale-t-il un gène? Si chaque codon était tiré au hasard, uniformément parmi les 64 (un modèle, pas une description des génomes), chaque codon serait un stop avec la probabilité , et le nombre de codons lus jusqu'au premier stop suivrait une loi géométrique («Probabilités et statistique», chapitre 4, définition 4.4 et théorème 4.7) de moyenne . La probabilité de lire 100 codons de suite sans stop vaut
et pour 300 codons environ . Un ORF de plusieurs centaines de codons n'est donc presque jamais un accident: c'est le premier critère d'annotation des génomes bactériens. Chez les eucaryotes, les introns brisent les ORF, et l'annotation s'appuie sur les ADNc.
L'explorateur 8.1 montre ce que devient un cadre de lecture quand la séquence change d'une base.
Un ARNm fictif de 30 nucléotides est lu codon par codon avec le code standard. Choisissez le cadre (+1, +2 ou +3, selon le nucléotide où commence la lecture), puis une position et un changement: une substitution remplace la base par sa partenaire de transition (A↔G, C↔U), une insertion ajoute un A juste après la position, une délétion retire la base. Dans le cadre +1, comparez une substitution en 6 (synonyme), en 8 (non-sens) et en 13 (faux-sens), puis une insertion ou une délétion en 13: tout l'aval change, et le stop se déplace ou sort de la fenêtre.
Une substitution change au plus un codon: peptide inchangé si le codon est synonyme, autre acide aminé (faux-sens), ou arrêt s'il est devenu un stop (non-sens). Une insertion ou une délétion d'une base décale le cadre: tout l'aval est relu autrement, et un stop survient en général vite, puisque rien n'a écarté les stops des cadres non utilisés. Le chapitre 9 classe ces mutations.
Comment le code a été déchiffré
Le code est lu par triplets. En 1961, Francis Crick, Leslie Barnett, Sydney Brenner et Richard Watts-Tobin obtiennent, chez le bactériophage T4 traité à la proflavine (qui insère ou retire une base), des mutants du gène rII sans fonction. Un mutant «+» combiné à un mutant «−» proche retrouve souvent une fonction, deux «+» ou deux «−» jamais, et trois «+» (ou trois «−») la retrouvent. Un «+» décale le cadre, le «−» suivant le remet en place, et seuls les codons intermédiaires sont lus de travers; trois insertions ajoutent un codon entier. Le codon a donc 3 bases (ou un multiple de 3, peu plausible), la lecture part d'un point fixe et n'a pas de ponctuation: sinon, un décalage serait corrigé au signal suivant.
Les premiers mots. La même année, Marshall Nirenberg et Heinrich Matthaei ajoutent à un extrait d'E. coli capable de synthétiser des protéines un ARN synthétique fait uniquement d'uraciles, le poly(U): l'extrait fabrique de la polyphénylalanine, donc UUU code Phe. Le poly(A) donne de la polylysine, le poly(C) de la polyproline. Har Gobind Khorana synthétise ensuite des ARN à motif répété (exemple 8.3), et en 1964 Nirenberg et Philip Leder montrent qu'un trinucléotide suffit à fixer sur le ribosome l'ARNt de l'acide aminé correspondant. Vers 1966, les 64 codons étaient attribués.
Dégénérescence et vacillement
Une cellule ne possède pas 61 ARNt différents, un par codon-sens: elle en a moins, car un même ARNt peut lire plusieurs codons synonymes. L'ARNt reconnaît le codon par son anticodon, trois bases qui s'apparient au codon de façon antiparallèle: la première base de l'anticodon (lu de 5′ à 3′) fait face à la troisième base du codon. En 1966, Crick a proposé que cette position soit moins contrainte que les deux autres.
Justification. C'est une règle empirique: Crick l'a formulée pour rendre compte des spécificités mesurées des ARNt purifiés, notamment de la présence d'inosine (une base modifiée dérivée de l'adénosine) dans l'anticodon de certains d'entre eux; les structures du ribosome ont confirmé depuis que la troisième position du codon est moins surveillée que les deux premières. Les bases modifiées de l'anticodon étendent ou restreignent ces règles selon les organismes: le tableau décrit le cas de base.
Un ARNt porte l'anticodon 5′-IGC-3′ (I = inosine). Quels codons peut-il lire, et quel acide aminé porte-t-il?
Un code presque universel
Les mêmes 64 correspondances valent chez E. coli, la levure et l'humain: c'est un argument fort pour une origine commune du vivant, et ce qui permet de faire produire l'insuline humaine par une bactérie. «Presque», parce que des variantes existent, surtout dans les mitochondries. Le génome mitochondrial humain, 16 569 pb, ne code que 13 protéines, avec ses propres 22 ARNt et son propre code: UGA y code le tryptophane au lieu d'arrêter la traduction, AUA y code la méthionine au lieu de l'isoleucine, et AGA et AGG n'y sont lus par aucun ARNt et terminent la traduction. Avec seulement 22 ARNt pour une soixantaine de codons-sens, le vacillement y est poussé plus loin: dans les familles de quatre, un seul ARNt, portant un U non modifié en première position de l'anticodon, lit les quatre codons. D'autres écarts existent chez certains ciliés et certaines bactéries.
La traduction
Charger les ARN de transfert
Le code n'est pas une affinité chimique entre codon et acide aminé, mais une correspondance établie par des enzymes. Chaque ARNt, environ 80 nucléotides repliés en L, porte l'anticodon à une extrémité et l'acide aminé à l'autre, sur l'adénosine de la séquence terminale CCA en 3′. Une aminoacyl-ARNt synthétase, en général une par acide aminé, active l'acide aminé par l'ATP (aminoacyl-adénylate et pyrophosphate) puis le transfère sur l'ARNt: l'aminoacyl-ARNt porte une liaison riche en énergie qui servira à former la liaison peptidique.
C'est à cette étape que le code est réellement «écrit»: le ribosome ne vérifie que l'appariement codon–anticodon, jamais l'acide aminé. Un ARNt de la cystéine dont la cystéine a été convertie chimiquement en alanine fait incorporer de l'alanine aux codons de la cystéine (Chapeville et collègues, 1962). Les synthétases ont donc un site de correction qui hydrolyse les acides aminés mal chargés.
Le ribosome et ses trois sites
Le ribosome a deux sous-unités faites d'ARN ribosomiques et de dizaines de protéines: 30S et 50S chez les bactéries (ribosome 70S), 40S et 60S chez les eucaryotes (80S); ce sont des coefficients de sédimentation, qui ne s'additionnent pas. La petite sous-unité lie l'ARNm et contrôle l'appariement codon–anticodon; la grande catalyse la liaison peptidique dans le centre peptidyl-transférase, fait d'ARN: les structures publiées en 2000 ont confirmé que le ribosome est un ribozyme.
Le ribosome présente trois sites pour les ARNt, rangés dans le sens de la lecture.
- Le site A (aminoacyl) accueille l'aminoacyl-ARNt qui correspond au codon suivant.
- Le site P (peptidyl) porte l'ARNt auquel est attachée la chaîne en cours de synthèse.
- Le site E (exit, sortie) retient brièvement l'ARNt déchargé avant qu'il ne quitte le ribosome.
Initiation, élongation, terminaison
L'initiation place un ARNt initiateur, chargé d'une méthionine (d'une formylméthionine chez les bactéries), sur le codon de départ AUG, au site P: elle fixe ainsi le cadre de lecture. La façon de trouver le bon AUG diffère.
- Chez les bactéries, la petite sous-unité se fixe sur l'ARNm grâce à une courte séquence riche en purines située en amont de l'AUG, la séquence de Shine-Dalgarno, qui s'apparie à l'extrémité 3′ de l'ARN ribosomique 16S: un ARNm polycistronique a ainsi un site d'initiation par région codante.
- Chez les eucaryotes, la petite sous-unité, avec l'ARNt initiateur et des facteurs d'initiation, se fixe à la coiffe puis balaie l'ARNm de 5′ vers 3′ jusqu'au premier AUG dans un contexte favorable (le contexte de Kozak), où la grande sous-unité la rejoint. L'ARNm eucaryote est donc le plus souvent monocistronique.
L'élongation est un cycle qui se répète pour chaque codon. Un aminoacyl-ARNt, escorté par un facteur d'élongation lié au GTP (EF-Tu chez les bactéries), entre au site A; si son anticodon s'apparie correctement au codon, le GTP est hydrolysé et le facteur se retire. Le centre peptidyl-transférase transfère alors la chaîne portée par l'ARNt du site P sur l'acide aminé de l'ARNt du site A: la chaîne s'allonge d'un résidu par son extrémité C. Un second facteur lié au GTP (EF-G) fait ensuite transloquer le ribosome d'un codon vers 3′: l'ARNt porteur de la chaîne passe en P, l'ARNt déchargé passe en E et sort, et le site A, vide, présente le codon suivant.
Remettez dans l'ordre les étapes d'un cycle d'élongation, en partant d'un ribosome dont le site P porte l'ARNt chargé de la chaîne et dont le site A est vide.
Glissez les éléments pour les mettre dans le bon ordre
- La chaîne portée par l'ARNt du site P est transférée sur l'acide aminé de l'ARNt du site A
- L'ARNt déchargé quitte le ribosome par le site E
- L'anticodon est apparié au codon et le GTP est hydrolysé; le facteur se retire
- Le ribosome transloque d'un codon vers l'extrémité 3′ de l'ARNm
- Un aminoacyl-ARNt, lié à un facteur d'élongation et au GTP, entre au site A
La terminaison survient quand un codon stop arrive au site A. Aucun ARNt ne le reconnaît: ce sont des facteurs de terminaison, des protéines (RF1 et RF2 chez les bactéries, eRF1 chez les eucaryotes), qui s'y placent et font hydrolyser la liaison entre la chaîne et le dernier ARNt. La protéine est libérée, et les deux sous-unités se séparent et sont recyclées.
Dès que le premier ribosome a avancé, un deuxième s'engage sur l'ARNm, puis un troisième: l'ensemble forme un polysome. Chez les eucaryotes, un codon stop situé nettement en amont de la dernière jonction exon–exon signale en général une erreur, et l'ARNm est détruit par la dégradation des ARNm non-sens (nonsense-mediated decay): une mutation non-sens précoce aboutit souvent à l'absence de protéine plutôt qu'à une protéine courte (chapitre 9). Enfin, plusieurs familles d'antibiotiques bloquent le ribosome bactérien sans toucher le ribosome 80S humain («Pharmacologie»).
Le coût d'une protéine
La charge de chaque ARNt consomme un ATP hydrolysé en AMP et pyrophosphate, soit deux liaisons riches en énergie; chaque cycle d'élongation consomme deux GTP. Une liaison peptidique coûte donc environ quatre liaisons riches en énergie (Alberts), sans compter l'initiation, les corrections, ni la synthèse des ARNm et des ribosomes. La traduction est l'un des plus gros postes de dépense d'une cellule en croissance, une raison de plus de régler l'expression des gènes (chapitre 10).
Après la traduction
La chaîne qui sort du ribosome se replie, souvent aidée de chaperonnes, et peut être modifiée: retrait de la méthionine initiatrice, coupures, ajout de phosphates, de sucres ou de lipides, ponts disulfure, association à d'autres chaînes (le cours «Biochimie» en donne le détail). La β-globine perd sa méthionine: la chaîne mature commence par une valine, et l'ancienne numérotation de l'hémoglobine, qui part de cette valine, a un rang de retard sur la numérotation HGVS, qui part de l'AUG (chapitre 9). L'insuline est traduite en une seule chaîne, puis découpée en deux chaînes reliées par des ponts disulfure: «un gène, un polypeptide» parle de ce qui sort du ribosome, pas de ce qui agit.
Un gène, plusieurs produits
La colinéarité du gène et de la protéine
Si un gène est une suite de codons, l'ordre des mutations sur sa carte génétique doit être l'ordre des acides aminés modifiés. Charles Yanofsky et ses collègues l'ont vérifié en 1964 sur le gène trpA d'E. coli (chaîne A de la tryptophane synthétase): cartographie fine des mutations par recombinaison (chapitre 5), puis identification de l'acide aminé changé chez chaque mutant.
Justification. C'est un résultat empirique, établi par la comparaison d'une carte de recombinaison et des séquences protéiques des mutants. Il découle du modèle d'une région codante continue lue codon par codon; la proportionnalité n'est qu'approximative parce que la fréquence de recombinaison par paire de bases n'est pas uniforme le long d'un gène (chapitre 5).
Chez les eucaryotes, l'ordre est conservé, puisque les exons sont raboutés dans leur ordre, mais pas les distances: deux acides aminés voisins de la chaîne β peuvent être codés de part et d'autre des quelque 850 pb de l'intron 2. La colinéarité vaut entre la protéine et l'ARNm mature (ou son ADNc), non entre la protéine et le gène.
L'épissage alternatif
Un même pré-ARNm peut être épissé de plusieurs façons: un exon inclus ou exclu, deux exons mutuellement exclusifs, un site donneur ou accepteur déplacé. C'est l'épissage alternatif, réglé selon le type cellulaire et le stade de développement par des protéines qui se fixent sur le pré-ARNm (chapitre 10). Les études de séquençage des ARN de 2008 (Pan et collègues; Wang et collègues) ont estimé que plus de 90 % des gènes humains à plusieurs exons produisent au moins deux ARNm différents: les quelque 20 000 gènes codant une protéine en produisent bien davantage.
Le cas extrême est le gène Dscam de la drosophile: dans chacun de ses quatre groupes d'exons mutuellement exclusifs, un seul exon est retenu parmi 12, 48, 33 et 2, d'où ARNm possibles (Schmucker et collègues, 2000), davantage que le nombre de gènes de la drosophile.
Qu'est-ce qu'un gène aujourd'hui?
«Un gène, une enzyme» ignorait les protéines non enzymatiques; «un gène, un polypeptide» ignore les gènes à ARN, l'épissage alternatif, les gènes chevauchants et les protéines découpées. Reste l'idée d'une unité fonctionnelle définie par ses produits.
Cette définition, proche de celle de Gerstein et collègues (2007) après le projet ENCODE, n'est pas un théorème: les annotations divergent justement sur les gènes qui se chevauchent ou partagent des exons, et c'est pourquoi le nombre de gènes humains codant une protéine se donne en ordre de grandeur, environ 20 000. L'allèle reste ce qu'il était au chapitre 2: une version d'une séquence à un locus.
Synthèse
- Les auxotrophes de Beadle et Tatum ont conduit à «un gène, une enzyme», élargi en «un gène, un polypeptide» (l'hémoglobine A, , dépend de HBA1, HBA2 et HBB). Le dogme central interdit le retour de l'information de la protéine vers les acides nucléiques; la transcription inverse et les gènes à ARN élargissent le schéma sans le contredire.
- La transcription lit le brin matrice de 3′ vers 5′ et produit un ARN 5′→3′ de même séquence que le brin codant, U pour T. Bactéries: une polymérase, un facteur σ qui reconnaît les motifs et , transcription et traduction couplées. Eucaryotes: trois polymérases et des facteurs généraux.
- Le pré-ARNm reçoit une coiffe et une queue poly(A); le spliceosome excise les introns (règle GU–AG, lasso). Des mutations d'épissage causent une part des β-thalassémies. L'épissage alternatif concerne plus de 90 % des gènes humains à plusieurs exons ( ARNm pour trois exons facultatifs indépendants).
Un gène fictif a pour brin codant la séquence génomique 5′-ATGTCTCAAG GTAAGTGATC CTTTCTATAG CTTGGAAAAT GGCTTAA-3′ (47 nucléotides, du codon de départ au stop, écrits par groupes de dix). Après RT-PCR (chapitre 11), son ADNc, copie de l'ARNm mature, a pour séquence 5′-ATGTCTCAAG CTTGGAAAAT GGCTTAA-3′. On cherche l'intron, la protéine, et l'effet d'une mutation de son site donneur.
Trouver l'intron
Alignez les deux séquences: elles coïncident sur les dix premiers nucléotides, puis l'ADNc reprend plus loin dans la séquence génomique.
Combien de nucléotides compte l'intron?
La protéine
Le codon à cheval sur la jonction
Le site donneur muté
Exercices
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Le brin matrice d'un petit gène fictif est donné de 5′ à 3′: 5′-TTACCCAGCGGTCAT-3′.
- Écrivez le brin codant de 5′ à 3′.
- Écrivez l'ARNm de 5′ à 3′.
- Traduisez-le.
- Un étudiant a recopié le brin matrice en remplaçant T par U et l'a traduit tel quel. Quel peptide a-t-il obtenu, et pourquoi le résultat ne peut-il pas être le bon?
Solution
- Le brin codant est le complémentaire antiparallèle du brin matrice. On écrit le brin matrice de 3′ à 5′,
3′-TACTGGCGACCCATT-5′, et on complète base par base:5′-ATGACCGCTGGGTAA-3′. - L'ARNm a la séquence du brin codant, U pour T:
5′-AUGACCGCUGGGUAA-3′. AUG ACC GCU GGG UAA: Met-Thr-Ala-Gly-Stop. Le peptide est Met-Thr-Ala-Gly, quatre acides aminés.- Il a lu
UUA CCC AGC GGU CAU, Leu-Pro-Ser-Gly-His: pas d'AUG, pas de stop, et surtout un ARN identique au brin matrice, alors que l'ARNm en est le complémentaire. C'est le piège de l'encadré sur le brin matrice.
Utilisez la figure 8.2.
- Combien de séquences d'ARNm différentes, codon stop compris, codent le peptide Met-Trp-His-Leu suivi d'un stop?
- On considère les neuf substitutions d'une seule base possibles dans le codon UGG (Trp). Combien sont synonymes, faux-sens et non-sens?
- Même question pour le codon GCU (Ala).
- Pourquoi les résultats de 2 et 3 sont-ils si différents? Reliez la réponse à la structure de la table.
Solution
- Met: 1 codon; Trp: 1; His: 2 (CAU, CAC); Leu: 6; stop: 3. Le nombre de séquences est .
- Pour UGG, en première position: AGG (Arg), CGG (Arg), GGG (Gly), trois faux-sens. En deuxième: UAG (stop), UCG (Ser), UUG (Leu), un non-sens et deux faux-sens. En troisième: UGA (stop), UGC (Cys), UGU (Cys), un non-sens et deux faux-sens. Bilan: .
La région codante de l'ARNm mature d'un gène fictif, codon stop compris, est répartie sur quatre exons: 100 nucléotides dans l'exon 1 (à partir de l'AUG), 84 dans l'exon 2, 92 dans l'exon 3 et 141 dans l'exon 4 (jusqu'au stop inclus).
- Combien d'acides aminés compte la protéine normale?
- Une mutation du site accepteur de l'intron 1 fait sauter l'exon 2. Le cadre est-il conservé? Si oui, combien d'acides aminés compte la protéine?
- Une autre mutation fait sauter l'exon 3. Que se passe-t-il?
- Une troisième mutation fait retenir l'intron 1, de 151 nucléotides. Pourquoi la protéine produite, s'il y en a une, est-elle presque sûrement anormale, même si l'intron ne contenait aucun stop dans le cadre?
Solution
- nucléotides, soit 139 codons, dont un stop: 138 acides aminés.
Une séquence fictive de 30 pb a pour brin donné 5′-ATTCATGGCATACGCGGAGCTCTAAATTTA-3′.
- Écrivez son complément inverse, de 5′ à 3′.
- Découpez et traduisez les six cadres de lecture.
- Identifiez les ORF complets (de ATG à un stop du même cadre). Lequel est le plus long, et combien d'acides aminés code-t-il?
- Le cadre −1 commence par un stop et contient un ATG vers la fin. Que pouvez-vous en dire?
Solution
- Complément inverse:
5′-TAAATTTAGAGCTCCGCGTATGCCATGAAT-3′. - Les six cadres:
| Cadre | Codons | Traduction |
|---|---|---|
| +1 | ATT CAT GGC ATA CGC GGA GCT CTA AAT TTA | Ile-His-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Leu-Asn-Leu |
| +2 | TTC ATG GCA TAC GCG GAG CTC TAA ATT | Phe-Met-Ala-Tyr-Ala-Glu-Leu-Stop-Ile |
| +3 | TCA TGG CAT ACG CGG AGC TCT AAA TTT | Ser-Trp-His-Thr-Arg-Ser-Ser-Lys-Phe |
| −1 | TAA ATT TAG AGC TCC GCG TAT GCC ATG AAT | Stop-Ile-Stop-Ser-Ser-Ala-Tyr-Ala-Met-Asn |
| −2 | AAA TTT AGA GCT CCG CGT ATG CCA TGA | Lys-Phe-Arg-Ala-Pro-Arg-Met-Pro-Stop |
| −3 | AAT TTA GAG CTC CGC GTA TGC CAT GAA | Asn-Leu-Glu-Leu-Arg-Val-Cys-His-Glu |
- Deux ORF complets. Dans le cadre +2:
ATG GCA TAC GCG GAG CTC TAA, 21 nucléotides, 6 acides aminés (Met-Ala-Tyr-Ala-Glu-Leu): c'est le plus long. Dans le cadre −2:ATG CCA TGA, 9 nucléotides, 2 acides aminés (Met-Pro). Le cadre +1 contientCAT GGC, où ATG est à cheval sur deux codons: il ne compte pas dans ce cadre (c'est précisément l'ATG du cadre +2). - L'ATG du cadre −1 () n'est suivi d'aucun stop avant la fin: ORF . Pour savoir s'il est long, il faudrait la suite de ce brin, c'est-à-dire la séquence en amont du brin donné.
Un ORF fictif a pour brin codant 5′-ATGATTAACCGATCGTTTAGAACATCTCGAATCTGA-3′ (36 nucléotides). On construit, à la manière de Crick et de ses collègues, des mutants de décalage. Les positions sont numérotées de 1 à 36 sur la séquence d'origine.
- Traduisez l'ORF d'origine. Combien d'acides aminés code-t-il?
- Mutant «+»: un A est inséré entre les positions 6 et 7. Traduisez jusqu'au premier stop.
- Double mutant «+ −»: à l'insertion précédente s'ajoute la délétion du T de la position 16. Traduisez. Combien d'acides aminés diffèrent de la protéine d'origine, et la longueur est-elle rétablie?
- Double mutant «+ −» bis: la même insertion, mais la délétion porte sur le C de la position 28. Traduisez, et expliquez pourquoi celui-ci ne retrouve pas la fonction, alors que le précédent la retrouve peut-être.
- Qu'apportent ces deux doubles mutants à l'argument de Crick pour un code de triplets lu à partir d'un point fixe?
Solution
ATG ATT AAC CGA TCG TTT AGA ACA TCT CGA ATC TGA: Met-Ile-Asn-Arg-Ser-Phe-Arg-Thr-Ser-Arg-Ile-Stop, 11 acides aminés.- La séquence devient
ATG ATT AAA CCG ATC GTT TAG …: Met-Ile-Lys-Pro-Ile-Val, puis le stop TAG. Le peptide est tronqué à 6 acides aminés, dont 4 différents de l'origine (Lys, Pro, Ile, Val au lieu de Asn, Arg, Ser, Phe). - Après l'insertion et la délétion du T 16, la séquence se lit
ATG ATT AAA CCG ATC GTT AGA ACA TCT CGA ATC TGA: Met-Ile-Lys-Pro-Ile-Val-Arg-Thr-Ser-Arg-Ile. La longueur est rétablie (11 acides aminés) et 4 acides aminés diffèrent (positions 3 à 6); le cadre est remis en place à partir du codon 7. Le stop TAG qui arrêtait le mutant simple a disparu, car la délétion a eu lieu avant qu'il ne soit lu. - Avec la délétion en 28, le segment décalé s'étend des codons 3 à 10, et il contient le stop TAG déjà rencontré au point 2:
ATG ATT AAA CCG ATC GTT TAG. La traduction s'arrête à Met-Ile-Lys-Pro-Ile-Val, 6 acides aminés, avant d'atteindre la délétion, qui ne peut donc rien compenser. Un double mutant «+ −» ne retrouve la fonction que si le segment lu de travers est court, ne contient pas de stop, et que ses acides aminés changés sont tolérés.
Références
- Alberts, B. et al., Molecular Biology of the Cell, Norton (trad. Biologie moléculaire de la cellule, Lavoisier) — transcription, maturation, code, ARNt et ribosome.
- Klug, W. S., Cummings, M. R., Spencer, C. A. & Palladino, M. A., Concepts of Genetics, Pearson (trad. Génétique, Pearson) — Beadle et Tatum, déchiffrement du code, colinéarité.
- Griffiths, A. J. F., Doebley, J., Peichel, C. & Wassarman, D. A., Introduction to Genetic Analysis, Macmillan (trad. Introduction à l'analyse génétique, De Boeck) — auxotrophes, mutants de décalage.
- Strachan, T. & Read, A., Human Molecular Genetics, CRC Press — gènes humains, épissage, code mitochondrial.
- Nussbaum, R. L., McInnes, R. R. & Willard, H. F., Thompson & Thompson Genetics and Genomics in Medicine, Elsevier (trad. Génétique médicale, Elsevier Masson) — gènes de la globine, β-thalassémies.